本文摘要：MTT基本原理 MTT全称之为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，中文有机化学起名叫3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt噻唑蓝。是一种朱色调的染剂。 MTT酶活性测定，是一种检验细胞生存和生长发育的方式。

MTT基本原理　　MTT全称之为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，中文有机化学起名叫3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt噻唑蓝。是一种朱色调的染剂。　　MTT酶活性测定，是一种检验细胞生存和生长发育的方式。

其检验基本原理为活细胞膜蛋白中的琥珀酸脱氢酶能使外源MTT复原变成水不可溶的紫蓝色结晶体甲瓒(Formazan)并堆积在细胞中，而杀细胞不存在作用。二甲基亚砜(DMSO)能沉定细胞中的甲瓒，用酶益航人体免疫系统检查仪在490nm光波长处精确测量其吸光值，可间接性反映活细胞总数。在一定细胞数范畴内，MTT结晶体组成的量与细胞数正相关。

该方式已广泛作为一些微生物活性因子的特异性检验、规模性的抗癌药物检测、细胞毒副作用实验及其恶性肿瘤射线敏感度精确测量等。它的特性是敏感度低、经济发展。　　缺陷：因为MTT经转变成所造成的甲瓒物质不溶液水，需要被沉定后才可以检验。这不但使劳动量降低，也不会对试验結果的精确性造成危害，并且沉定甲的溶剂对实验者也是有损害。

　　MTT水溶液的提炼出方式　　一般来说，此方法中的MTT浓度值为5mg/ml。因而，能够称量MTT0.5克，溶液100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚白的培养液中，用0.22m滤纸过滤装置以去除水溶液里的病菌，敲4℃避光存留才可。在提炼出和存留的全过程中，器皿最烂用锡箔纸撕掉。试验的情况下我一般再开超净工作台上的日光灯管来避光，确实那样比较好。

　　务必注意的是，MTT法不可以用于检验细胞相对数和较为魅力，但没法精确测量细胞绝对数。再用酶标仪检验結果的情况下，为了更好地保证 试验結果的线形，MTT吸入亮度最烂在0-0.7范畴内。　　MTT一般最烂在用现配，过滤装置后4oC避光存留两个星期内合理地，或提炼出成5mg/ml存留在-20度长时间存留，避免 反复冻融循环，最烂剂量装填，用避光袋或者黑纸、锡纸撕掉避光以防转化成。

我一般都把MTT粉装填在EP菅理，用的情况下现配，必需往培育板里加，沒有适度一下子加上那么多,特别是在当MTT变为浅绿色时就意味著没法再用了。　　MTT有致癌物质，用的情况下小心,有标准最烂携带那类透明色的簿膜胶手套.配置的MTT务必无菌检测，MTT对菌很敏感;往96孔板加时赛不避光也没事儿，确是時间较短，或是你没舒心的情况下能够把作业者台子上的照明灯具启动.　　提炼出MTT时要PBS(ph=7.4)沉定。PBS秘方：Nacl8g Kcl0.3g Na2HPO41.44g KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L。　　一般MTT法实验步骤：　　1：预苗细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配置单独细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞预苗到96孔板，每孔容积200ul.　　2:培育细胞：同一般培育标准，培育3-5天(可依据实验目地和回绝规定培育時间)。

　　3：呈色：培育3-5天后，每孔加MTT水溶液(5mg/ml用PBS提炼出，pH=7.4)20ul.以后孵育4h，　　中断培育，小心吸弃孔内培育上清液，针对飘浮细胞务必抽滤后再作吸弃孔内培育上清液。每孔加150ulDMSO，起伏10min，使结晶体物充份溶化。

　　4：比色计：随意选择490nm光波长，在酶益航人体免疫系统监测仪器上精确测量各孔吸光值，纪录結果，以時间为横坐标轴，吸光度数值纵坐标绘图细胞生长曲线。　　药品MTT法实验步骤　　贴壁细胞：　　1:收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度值，每孔重新加入100ul,铺板使待测细胞徵相对密度1000-10000孔，(边沿孔用无菌检测PBS铺满)。　　2:5%CO2，37℃孵育，至细胞单面铺满孔底(96孔厚底板),重新加入浓度梯度的药品,应以，细胞贴壁后才可特药，或两小时，或大半天時间，但大家常常在前一天中午铺板，隔日早上投药.一般5-七个梯度方向,每孔100ul,设3-五个复孔.提议设五个，不然没法反映具体情况　　3:5%CO2，37℃孵育16-两天，条形显微镜下认真观察。

　　4:每孔重新加入20ulMTT水溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，以后培育4h。若药品与MTT必须反映，可再作抽滤后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再作重新加入含MTT的培养液。　　5:中断培育，小心吸掉孔内培养液。

　　6:每孔重新加入150ul二甲基亚砜，置摇床边短路线起伏10min，使结晶体物充份沉定。在酶益航人体免疫系统检查仪OD490nm一处精确测量各孔的吸光度值。　　7:另外设定徵零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对比孔(细胞、完全一致浓度值的药品沉定物质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

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